BUT
Le diagnostic de l'infection MAP est difficile en raison de la nature chronique de la maladie et de la présence de 4 stades. La plupart des animaux excrètent la bactérie bien avant l'apparition des signes cliniques et ces excréteurs propagent l'infection à d'autres animaux en contaminant l'environnement. Ainsi, il est important de diagnostiquer la présence de la bactérie bien avant l'apparition des signes cliniques. La méthode de PCR en temps réel telle que le Bio-T kit® Mycobacterium avium paratuberculosis permet une amplification et une quantification sensible de la cible MAP. Cependant, le processus d'analyse peut prendre beaucoup de temps et de main-d'oeuvre, en particulier dans le contexte d'une analyse quantitative. Pour cette raison, BioSellal a évalué une solution qPCR robuste, portable, fiable et capable d'analyser automatiquement les résultats quantitatifs.
MÉTHODES
Extraction de fèces
Des échantillons de fèces prélevés sur le terrain dans différents troupeaux de la Creuse (France) ont été préalablement caractérisés par PCR. Le prétraitement des échantillons et l'extraction de l'ADN ont été effectués comme indiqué dans le manuel d'extraction du Bio-T kit® Mycobacterium avium paratuberculosis en utilisant le BioExtract® Superball® (BioSellal, France).
Echantillon MRSI
Le matériel de référence au seuil d'interprétation (MRSI, Cat. N°MRSI-MAP-001) est constitué d'un échantillon de fèces négatif pour MAP supplémenté à 104 Equivalent Genome (EG)/g avec une suspension bactérienne titrée de MAP (SB-MAP-001). Ce niveau est utilisé comme seuil pour identifier les forts excréteurs (charge bactérienne > 104 EG/g) et les faibles excréteurs. Cet échantillon MRSI a été extrait en parallèle des échantillons terrain.
ADN standard
L'ADN synthétique de MAP a été dilué en série de 10 de 5.103 à 0,5 EG par réaction dans de l'eau "nuclease free", correspondant à 1,57x107 à 1,57x103 EG/g de matières fécales.
Configuration de la réaction
5μl d'ADN ont été mélangés avec 15 µl de Master Mix du Bio-T kit® Mycobacterium avium paratuberculosis dans une plaque pour thermocycleur de qPCR 7500FAST (Applied Biosystems) et dans un tube pour thermocycleur de qPCR MIC (BMS). Cette étape de dépôt a été réalisée à l'aide de l'automate de pipetage Myra (BMS).
Paramètres des cycles
Tous les échantillons et tous les contrôles ont été amplifiés sur le thermocycleur de qPCR 7500FAST (Applied Biosystems) en mode standard et sur le thermocycleur de qPCR MIC (BMS) en mode "fast". Le programme d'amplification du 7500FAST a été configuré selon les instructions indiquées dans le manuel d'utilisation du Bio-T kit® Mycobacterium avium paratuberculosis. Pour le programme du thermocycleur de PCR MIC, veuillez contacter BioSellal.
RÉSULTATS
Pour évaluer la possibilité d'utiliser le Bio-T kit® Mycobacterium avium paratuberculosis sur le thermocycleur de qPCR MIC, des échantillons terrain ont été analysés et comparés avec le thermocycleur de qPCR 7500FAST.
Figure 1: Comparaison de l'allure des courbes entre les thermocycleurs de qPCR 7500FAST et MIC avec le Bio-T kit® Mycobacterium avium paratuberculosis
=> L'allure des courbes d'amplification du Bio-T kit® Mycobacterium avium paratuberculosis pour MAP et l'IPC exogène est équivalente entre les thermocycleurs qPCR 7500FAST et MIC.
Pour valider les paramètres de quantification, l'ADN standard MAP dilué en série ainsi que le MRSI ont été analysés et comparés avec le thermocycleur de qPCR 7500FAST.
Figure 2: Comparaison des courbes et de l'efficacité entre les thermocycleurs de qPCR 7500FAST et MIC avec le Bio-T kit® Mycobacterium avium paratuberculosis
=> L'allure des courbes pour la cible MAP sur l'ADN standard et le MRSI est équivalente entre les thermocycleurs de qPCR 7500FAST et MIC.
Tableau 1 : Valeurs Ct de la courbe standard d'ADN et du MRSI : évaluation des paramètres de quantification entre les thermocycleurs de qPCR 7500FAST et MIC avec le Bio-T kit® Mycobacterium avium paratuberculosis
=> Les paramètres d'efficacité et de quantification pour la cible MAP sur les standards d'ADN et le MRSI sont équivalents entre les thermocycleurs de qPCR 7500FAST et MIC.
Ensuite, les valeurs Ct des échantillons terrain indiquées précédemment ont été comparées entre les thermocycleurs de qPCR 7500FAST et MIC.
Tableau 2: Comparaison des valeurs de Ct pour les échantillons terrain entre les thermocycleurs de qPCR 7500FAST et MIC avec le Bio-T kit® Mycobacterium avium paratuberculosis
* Echantillon avec une charge bactérienne inférieure à la limite de quantification
=> Les valeurs Ct pour la cible MAP sur les échantillons terrain sont équivalentes entre les thermocycleurs de qPCR 7500FAST et MIC, à l'exception d'un échantillon détecté sur le 7500FAST qui n'a pas été détecté sur le MIC. Néanmoins, cet échantillon est un échantillon très faiblement positif avec une charge virale inférieure à la limite de détection et de quantification.
Pour faciliter et accélérer l'analyse de la quantification absolue ou de la quantification relative de MAP, BioSellal a développé un modèle automatisé sur le logiciel d'analyses du MIC.
Figure 3: Analyse automatisée sur le logiciel MIC : quantification relative par rapport à l'échantillon MRSI
=> En utilisant un modèle prêt à l'emploi sur le logiciel très intuitif du MIC, la quantification relative de MAP par rapport au MRSI a été automatisée. L'état de l'échantillon est indiqué par un code couleur et la valeur de quantification relative est indiquée pour chaque échantillon.
Figure 4: Analyse automatisée sur le logiciel Mic : quantification absolue de la charge bactérienne MAP
=> En utilisant un modèle prêt à l'emploi sur le logiciel très intuitif du MIC, la quantification absolue de MAP a été automatisée. La valeur de quantification absolue est indiquée pour chaque échantillon.
CONCLUSIONS
BioSellal a évalué une nouvelle méthode sensible et rapide en utilisant le Bio-T kit® Mycobacterium avium paratuberculosis sur le thermocycleur qPCR MIC. Cette méthode peut être utilisée pour la quantification absolue ou relative de MAP à partir d'échantillons de fèces afin d'identifier rapidement la MAP, ce qui facilite le dépistage des échantillons d'animaux et la détection de MAP plus tôt avant l'apparition des symptômes. Le thermocycleur qPCR MIC peut tester jusqu'à 48 échantillons à la fois en seulement 38 minutes. Cette analyse a donné des Ct et une efficacité de la PCR identiques aux thermocycleurs de PCR en temps réel classiques, qui sont beaucoup plus volumineux. Les performances sont équivalentes tout en gagnant en vitesse et en portabilité. De plus, le MIC ne nécessité ni calibration, ni maintenance annuelle. Grâce à un logiciel très intuitif, une analyse automatisée a été développée par BioSellal soit pour une quantification relative par rapport au MRSI, soit pour une quantification absolue. Toutes ces données permettent un diagnostic MAP plus facile et plus rapide.
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