Evaluation du Bio-T kit^® AIV genotypes H5 & H7 V2 sur le thermocycleur MIC qPCR

BUT

Les virus de la grippe sont connus pour infecter de multiples espèces animales telles que les oiseaux, les porcs ou les humains. Certaines souches ont la capacité de provoquer une contamination inter-espèces et peuvent devenir pandémiques. C'est ce qui s'est passé avec la souche pandémique H1N1 en 2009. Afin de prévenir la propagation et la contamination de l'Homme, des animaux et de l'environnement, il est essentiel de détecter rapidement la circulation des virus grippaux. La méthode de PCR en temps réel telle que le Bio-T kit^® AIV genotypes H5 & H7 V2 permet une détection et un génotypage sensibles des virus de la grippe H5 et H7. De nouveaux dispositifs sont apparus sur le marché comme le thermocycleur MIC qPCR (BioMolecular System, Australie). Ce thermocycleur à induction magnétique permet une montée en puissance rapide et des résultats fiables. Dans un contexte où le délai de résultat est important, BioSellal a évalué l'utilisation du Bio-T kit^® AIV genotypes H5 & H7 V2 sur le thermocycleur MIC qPCR.

MÉTHODES

Echantillons

Afin d'évaluer l'utilisation du Bio-T kit^® AIV genotypes H5 & H7 V2 sur le thermocycleur MIC qPCR, des échantillons d'écouvillons, d'organes et de lingettes environnementales ont été analysés. Ces différents types d'échantillons ont été enrichis avec des souches de virus Influenza de type A inactivées, fournies par le Laboratoire national de référence (LNR), et dont la faible charge virale correspond au niveau de détection requis en France (plus faible concentration de virus à détecter, NED). Ensuite, les échantillons enrichis ont été extraits avec le kit d'extraction BioExtract^® SuperBall^®.

ARN standard

L'ARN synthétique de la grippe de type A a été dilué en série 10 fois pour atteindre un dernier niveau à 3 fois la limite de détection (3xLDRT-qPCR). Ces étapes de dilution ont été réalisées à l'aide du système de manipulation de liquides Myra.

Master Mix

Le Master Mix contenu dans le Bio-T kit^® AIV genotypes H5 & H7 V2 permet la détection des virus de l'influenza aviaire de type A sous-type H5 (H5) grâce à un marquage FAM, des virus de l'influenza aviaire de type A sous-type H7 (H7) grâce à un marquage VIC, d'un contrôle positif interne (IC) exogène grâce à un marquage Texas Red et d'un contrôle positif endogène (IPC) grâce à un marquage Cy5.

Configuration de la réaction

5 μl d'ARN ont été mélangés avec 15 μl de Master Mix du Bio-T kit® AIV genotypes H5 & H7 V2 dans une plaque pour le thermocycleur AriaMx^TM PCR et dans un tube MIC pour le thermocycleur MIC qPCR. Cette étape de mélange a été réalisée à l'aide du système de manipulation de liquides Myra.

Paramètres du run

Tous les échantillons et les contrôles sans matrice ont été amplifiés sur un thermocycleur AriaMx^TM et sur un thermocycleur MIC qPCR. Les paramètres de cycle de l’AriaMx^TM ont été configurés conformément au manuel du Bio-T kit® AIV genotypes H5 & H7 V2. Pour le programme du thermocycleur MIC qPCR, veuillez contacter BioSellal.

RÉSULTATS

Pour évaluer la possibilité d'utiliser le Bio-T kit^® AIV genotypes H5 H7 V2 sur le thermocycleur MIC qPCR, des échantillons enrichis et des ARN standards ont été analysés et comparés avec le thermocycleur de PCR en temps réel AriaMx^TM.

     ARN Standard

Figure 1 : Comparaison des formes des courbes et des valeurs de Ct pour les standards synthétiques de l'ARN du virus de l'influenza aviaire sous-types H5 et H7 entre les thermocycleurs AriaMx^TM et MIC qPCR avec le Bio-T kit^® AIV genotypes H5 & H7 V2

=> Les formes des courbes et les valeurs Ct pour les cibles H5 et H7 sur l'ARN standard sont similaires entre les thermocycleurs AriaMx^TMTM et MIC qPCR.

     Echantillons d’écouvillons

Figure 2 : Comparaison des formes des courbes et des valeurs Ct pour les sous-types H5 et H7 des échantillons d'écouvillons faiblement positifs pour le virus de la grippe entre les thermocycleurs AriaMx^TM et MIC qPCR avec le Bio-T kit^® AIV genotypes H5 & H7 V2

=> Les formes des courbes et les valeurs Ct pour les cibles H5, H7, IC exogène et IPC endogène sur les échantillons d'écouvillon enrichis sont similaires entre les thermocycleurs AriaMx^TM et MIC qPCR.

     Organes

Figure 3 : Comparaison des formes des courbes et des valeurs de Ct pour les sous-types H5 et H7 des échantillons d'encéphale faiblement positifs pour le virus de la grippe entre les thermocycleurs AriaMx^TM et MIC qPCR avec le Bio-T kit^® AIV genotypes H5 & H7 V2

=> Les formes des courbes et les valeurs Ct pour les cibles H5, H7, IC exogène et IPC endogène sur les échantillons d'encéphale enrichis sont similaires entre les thermocycleurs AriaMx^TM et MIC qPCR.

     Lingettes environnementales

Figure 4 : Comparaison des formes des courbes et des valeurs Ct pour les sous-types H5 et H7 des lingettes environnementales faiblement positives pour le virus de la grippe entre les thermocycleurs AriaMx^TM et MIC qPCR avec le Bio-T kit^® AIV genotypes H5 & H7 V2

=> Les formes des courbes et les valeurs Ct pour H5 et H7 sont meilleures avec le thermocycleur MIC qPCR. Pour les cibles IC exogènes et IPC endogènes sur des lingettes environnementales enrichies, les formes des courbes et les valeurs Ct sont similaires entre les thermocycleurs AriaMx^TM et MIC qPCR.

NB : Les valeurs Ct et les formes des courbes de la cible IPC endogène ne sont pas pertinentes dans cette matrice en raison du faible nombre de cellules présentes dans ce type d'échantillon.

CONCLUSIONS

BioSellal a évalué une nouvelle méthode sensible utilisant le Bio-T kit® AIV genotypes H5 & H7 V2 sur le thermocycleur MIC qPCR. Cette méthode peut être utilisée pour la détection des virus de la grippe aviaire à partir d'écouvillons, d'organes et de lingettes environnementales. Le thermocycleur MIC qPCR peut tester jusqu'à 48 échantillons à la fois en 1 heure et 45 minutes. Cette analyse a donné des valeurs Ct et des formes de courbes similaires ou meilleures, selon le type d'échantillon, sur le thermocycleur MIC qPCR par rapport à un thermocycleur de PCR en temps réel classique plus volumineux. Les performances sont équivalentes avec un gain de portabilité et de fiabilité. Une autre note d'application concernant l'utilisation du Bio-T kit^® Avian & Swine Influenza Virus V2 semble indiquer une meilleure résistance aux inhibiteurs sur le thermocycleur MIC qPCR (veuillez contacter BioSellal pour plus d'informations). De plus, il élimine le besoin d'étalonnage, d'entretien annuel et d'entretien préventif. Toutes ces données permettent un diagnostic et un génotypage plus facile et plus rapide des virus de l'influenza aviaire. Le Bio-T kit® AIV genotypes H5 & H7 V2 permet le génotypage des virus de la grippe aviaire H5 et H7 et peut être utilisé après une détection du virus de la grippe aviaire avec le Bio-T kit^® Avian & Swine Influenza Virus V2, également compatible avec le thermocycleur MIC qPCR. Une note d'application est disponible pour cette application (veuillez contacter BioSellal pour plus d'informations : contact@biosellal.com).

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